Методические указания по обнаружению, идентификации и определению содержания афлатоксинов в продовольственном сырье и пищевых продуктах с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии

Афлатоксины представляют собой токсины, продуцируемые микроскопическими грибами Aspergillus flavus и A. Parasiticus. В естественных условиях афлатоксины загрязняют арахис, кукурузу, некоторые зерновые, бобы какао и ряд других пищевых продуктов, а также корма сельскохозяйственных животных. Загрязнение афлатоксинами является серьезной проблемой для сельскохозяйственной продукции растительного происхождения из стран и регионов с субтропическим климатом.

Оптимальные условия для образования афлатоксинов могут также возникнуть при неправильном хранении сельскохозяйственной продукции, например при самосогревании зерна.

В естественных условиях встречаются 4 афлатоксина: афлатоксины В1 и В2(синяя флуоресценция в длинноволновом диапазоне УФ свете) и афлатоксины G1 иG2 (сине-зеленая флуоресценция). Среди них высокими токсическими свойствами инаиболее широкой распространенностью выделяется афлатоксин В1.

С молоком коров, потреблявших корма, загрязненные афлатоксинами В1 и В2,может выделяться до 3% потребленных афлатоксинов в виде соответствующих гидрооксилированных метаболитов - афлатоксинов М1 и М2.

Биологическая активность афлатоксинов проявляется в виде как острого токсического эффекта, так и отдаленных последствий - канцерогенного, мутагенного и тератогенного эффектов. В настоящее время существуют убедительные эпидемиологические данные, указывающие на прямую корреляцию между частотой первичного рака печени и уровня содержания афлатоксинов в пищевых продуктах в ряде стран Юго-Восточной Азии.

В СССР установлены ПДК на содержание афлатоксина В1 в пищевых продуктах на уровне 5 мкг/кг. Для производственного сырья, предназначенного для производства продуктов детского питания, и готовых продуктов детского и диетического питания установлена ПДК афлатоксина В1 на уровне 1 мкг/кг (предел чувствительности ТСХ-метода). Для молока и молочных продуктов установлена ПДК афлатоксина М1 на уровне 0.5 мкг/кг.

В основе настоящих методических указаний лежит метод определения афлатоксинов по изменению интенсивности их флуорсценции при высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) или по поглощению Уф света при использовании УФ-детектора. Качественное подтверждение наличия афлатоксинов проводят с помощью двумерной ТСХ. Предел обнаружения метода для афлатоксина В1 - 0.1 мкг/кг, для афлатоксина М1 - 0.02 мкг/кг (при использовании флуоресцентного детектора) и 1.0 мкг/кг для афлатоксина В1, 0.5 мкг/кг для афлатоксина М1 (при использовании УФ-детектора). Относительное стандартное отклонение метода составляет 0.05-0.1. Степень извлечения афлатоксина В1 78-80%, афлатоксина М1 72-76%. Продолжительность анализа 2-2.5 часа.

Метод включает следующие стадии:

• экстракцию афлатоксинов из образца;
• очистку экстрактов от белков, липидов, пигментов;
• разделение, идентификацию и определение содержания афлатоксинов с помощью нормально фазовой ВЭЖХ с флуоресцентным или ультрафиолетовым детекторами.

Методические указания предназначены для использования лабораториями институтов гигиенического профиля и базовых санэпидстанций, осуществляющих контроль за импортируемой продукцией, а также при изучении частоты и уровней загрязнения пищевых продуктов и продовольственного сырья афлатоксинами. Настоящие методические указания могут использоваться наряду с действующими в настоящее время "Методическими рекомендациями по обнаружению, идентификации и определению содержания афлатоксинов в пищевых продуктах и продовольственном сырье" №2273-80, отличаясь от последних более высокой чувствительностью и воспроизводимостью методов анализа, а также сокращенным временем проведения анализа.

ОБОРУДОВАНИЕ И МАТЕРИАЛЫ

1. Аппарат для встряхивания проб типа АВУ-6С, ТУ 64-1-2451-78;
2. Ротационный испаритель с ловушкой, модель ИР-2 М, по ТУ 25-11-917-76 (завод "Химлабприбор") или аналогичный;
3. Кофемолка ЭКМ-3У;
4. Прибор для флуоресцентного анализа витаминов в растворе (модель 833), ТУ 64-1-1080-78 или диагностическая лампа ОЛД-41;
5. Жидкостный хроматограф высокой эффективности "Altex" модель 336 илидругой хроматограф с аналогичными параметрами; колонка и предколонка с силикагелем типа "Ultrasphere Si", с размером частиц 5 мкм; длина колонки 25 см, предколонки 4.5 см, внутренний диаметр колонок 0.46 см; флуоресцентный детектор "Kratos" модель FS-970 с кюветой заполненной силикагелем или другой детектор с аналогичными параметрами; ультрафиолетовый детектор "Kratos";
6. Микрошприц на 25 мкл;
7. Стеклянные камеры для ТСХ с притертыми крышками, например, стеклянные четырех угольные сосуды 195х195х200 мм завода "дружная горка";
8. Пластинки для ТСХ "Силуфол" размером 15х15 или 20х20 см, ЧСФР;
9. Воронки делительные ВД2-250 или ВД2-500, ГОСТ 8613-75;
10. Силикагель для колоночной хроматографии с размером частиц 100-250 мкм (силикагель ЧСФР).
11. Цилиндры мерные на 100 мл с притертой пробкой, тип 2-100 ГОСТ 177074;
12. Цилиндры мерные на 250 мл с притертой пробкой, тип 2-250 по гост 177074;
13. Колбы плоскодонные конические на 250 и 500 мл с НШ29 тип КнКШ 25029/32 и КнКШ 500-29/32 по ГОСТ 10394-72;
14. Колбы круглодонные на 1000 мл с НШ29, тип ККШ 250-29/32 по ГОСТ 10394-72;
15. Колбы грушевидные на 50 мл с НШ 14.5, тип ГрКШ 50-14/23 по ГОСТ 10394-72;
16. Воронки химические диаметром 150 мм по ГОСТ 8613-75;
17. Колонка стеклянная хроматографическая 2300х15 мм;
18. Распылитель стеклянный с грушей;
19. Афлатоксин В1 или смесь афлатоксинов В1, В2, G1, G2;
20. Афлатоксин М1;
21. Ацетон, чда, ГОСТ 2603-71;
22. Гексан по ТУ 6-093375-73;
23. Бензол, чда, ГОСТ 5955-75;
24. Ацетонитрил, ч, ТУ 6-09-3543-74;
25. Метанол по ГОСТ 6995-77;
26. Хлороформ медицинский по ГОСТ 3160-51;
27. Эфир диэтиловый медицинский по ГОСТ 6265-52;
28. Вода дистиллированная, ГОСТ 6709;
29. Кислота лимонная по ГОСТ 3652-29;
30. Кислота азотная концентрированная по ГОСТ 4461-67;
31. Сульфат натрия безводный по ГОСТ 4166-76;
32. Натрий хлористый по ГОСТ 4233-66;
33. Свинец уксуснокислый по ГОСТ 1027-67;
34. Окись алюминия для колоночной хроматографии (нейтральный) 40/250 (ЧСФР).

1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АФЛАТОКСИНОВ В1, В2, G1, G2 В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ

1.1.ЭКСТРАКЦИЯ

При отборе проб следует руководствоваться требованиями ГОСТа 12330-66 "Сельскохозяйственная продукция. Методы отбора образца при карантинном досмотре и экспертизе". Отобранную пробу измельчают в течение 1-2 минут в кофемолке или лабораторной мельнице. Навеску 25 г измельченного продукта помещают в плоскодонную коническую колбу на 250 мл, тщательно перемешивают с 25 мл 10% го раствора хлорида натрия. Добавляют 100 мл ацетона и встряхивают на аппарате для встряхивания в течение 30 минут. Полученную смесь фильтруют через бумажный складчатый фильтр, отбирают 50 мл фильтрата.

1.2.ОЧИСТКА ЭКСТРАКТА

К 50 мл фильтрата добавляют 20 мл 15%-го раствора ацетата свинца и 30 мл дистиллированной воды, перемешивают и оставляют стоять на 10 минут в темноте. Отфильтровывают образовавшийся осадок через бумажный складчатый фильтр, отбирают 80 мл фильтра. Обезжиривают в делительной воронке гексаном (2х30 мл), затем пере экстрагируют в хлороформ (1-й раз 30 мл хлороформа, 2-й раз смесью хлороформ-ацетон 3:1 - 45 мл). Объединяют хлороформные экстракты помещают в плоскодонную колбу на 250 мл, добавляют 5-7 г безводного сульфата натрия, встряхивают и оставляют стоять на 30 минут в темноте. Раствор фильтруют через кусочек ваты, помещенный в химическую воронку, в грушевидную колбу.

Хлороформный раствор упаривают на ротационном испарителе до объема 1 мл. Далее производят очистку экстракта с помощью колоночной хроматографии. На дно стеклянной колонки помещают кусочек ваты, затем безводный сульфат натрия (толщина слоя 5 мм), наливают суспензию 2 г силикагеля в хлороформе, сверху насыпают слой безводного сульфата натрия (20). Дают хлоформу стечь, затем на колонку наносят хлороформный экстракт образца, элюируют смесью хлороформ ацетон (9:1) 60 мл. Элюат упаривают досуха на ротационном испарителе, остаток растворяют в 2 мл хлороформа, фильтруют через бумажный или капроновый фильтр в пробирку емкостью 5 мл, отдувают растворитель в токе азота, остаток растворяют в 400 мкл хлороформа (раствор А) и анализируют с помощью ВЭЖХ.

1.3. ПРИГОТОВЛЕНИЕ СТАНДАРТНЫХ РАСТВОРОВ АФЛАТОКСИНОВ В1, В2, G1, G2;

Стандартные растворы готовят следующим образом:

Навески кристаллических афлатоксинов В1, В2, G1, G2 в 1 мг помещают в мерные колбы на 100 мл и доводят до метки смесью бензол-ацетонитрил (98:2). Концентрации афлатоксинов в приготовленных стандартных растворах составляют 10 нг/мкл.

Для приготовления рабочего раствора смеси афлатоксинов В1, В2, G1, G2 с концентрациями 0.5 нг/мкл, 0.25 нг/мкл, 0.2 нг/мкл, 0.1 нг/мкл соответственно в мерную колбу на 50 мл помещают 2.5 мл стандартного раствора афлатоксина В1, 1.25 мл В2, 1.0 мл G1 и 0.5 мл G2, затем доводят до метки смесью бензол ацетонитрил (98:2).

Стандартный раствор хранится в холодильнике при температуре ниже 00С, срок годности стандартного раствора 1 год.

1.4. ОБНАРУЖЕНИЕ И КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ АФЛАТОКИНОВ В1, В2, G1, G2 С ПОМОЩЬЮ ВЭЖХ.

Условия ВЭЖХ: подвижная фаза эфир-метанол-вода (95:4:1), скорость подвижной фазы 1.0 мл/мин. Рекомендуется использовать перегнанный метанол и бидистиллированную воду. Эфир перед использованием пропускают через колонку с оксидом алюминия. Все растворители необходимо предварительно отфильтровать.

Флуоресцентный детектор устанавливается на длину волны возбуждающего излучения 360 нм (или устанавливают соответствующий фильтр на линии возбуждения при работе с флуоресцентным детектором без монохроматора), на линии эмиссии устанавливается эмиссионный фильтр с полосой пропускания от 418 нм. Входное напряжение самописца - 10 мВ, чувствительность детектора устанавливается таким образом, чтобы 1 нг афлатоксина В1 соответствовало отклонение пера на полную шкалу самописца при уровне шума от 3 до 5% от полной шкалы. Предел обнаружения при таких условиях составляет около 0.1 нг афлатоксина В1 во вколе (при флуоресцентном детектировании).

Для калибровки прибора по флуоресцентному детектору в инжектор с помощью микрошприца вводится 1 мкл рабочего раствора для ВЭЖХ (соответствует 0.5 нг афлатоксина В1, 0.25 нг В2, 0.2нг G1, 0.1 нг G2) и 2 мкл рабочего раствора (1 нг В1, 0.5 нг В2, 0.4 нг G1, 0.2 нг G2 ). Для каждого количества афлатоксинов определяют высоту пика. В приведенных выше условиях время выхода растворителя составляет 3.0-3.5 минуты, времена удерживания афлатоксинов : для В1 9.0-10.0 мин., для В211.0-11.8 мин., для G1 13.0-14.0 мин., для G2 15.6-17.0 мин. В зависимости от небольших изменений с составе подвижной фазы и времени уравновешивания колонки.

При высоких уровнях загрязнения пищевых продуктов афлатоксинами (свыше 10 мг/кг по афлатоксину В1) рекомендуется использовать также показания УФдетектора. Калибровку прибора по УФ-детектору проводят также, как в случае флуоресцентного детектора, вводя в петлю инжектора 10, 15 и 20 мкл рабочего раствора (соответствует 5, 7.5 и 10 нг афлатоксина В1; 2.5, 3.75, 5 нг афлатоксина В2; 2, 3 и 4 нг G1; 1, 1.5 и 2 нг G2. Предел обнаружения по УФ-детектору составляет 1 нг по афлатоксину В1.

В инжектор хроматографа вводится с помощью микрошприца 20 мкл раствора А. При наличии пика, совпадающего по времени с афлатоксином В1 (В2, G1, G2) определяют его высоту (h). Расчет концентрации афлатоксина проводят по формуле:

         V1 x V3 x V5 x mст.x h

С = ------------------------------ мкг/кг

         V2 x V4 x V6 x M x hст.

Где С - концентрация афлатоксина в пищевом продукте в мкг/кг;

V1 - объем водно-ацетоновой смеси в мл (125 мл);

V2 - объем водно-ацетонового фильтрата, взятый для анализа в мл (50 мл);

V3 - объем водно-ацетонового фильтрата и раствора ацетата свинца (100 мл);

V4 - объем фильтрата после очистке ацетатом свинца (80 мл);

V5 - объем очищенного раствора экстракта в хлороформе перед ВЭЖХ (400 мкл);

V6 - объем раствора экстракта, вводимого в петлю инжектора хроматографа (20 мкл);

mст. - количество нг афлатоксина во введенном объеме стандарта;

hст. - высота пика стандарта афлатоксина в мм;

h - высота пика афлатоксина во введенном объеме экстракта в мм;

M -навеска образца, взятая в г.

При проведенных в скобках объемах и навесках формула содержания афлатоксина выражается следующим образом:

                h

С = 2.5 ------- x mст.

                hст.

Если пик афлатоксина выходит за пределы шкалы самописца, анализ с помощью ВЭЖХ, проводят повторно, уменьшая объем вводимого раствора экстракта (v6) или разбавляя раствор экстракта хлороформом ( увеличивая объем V5). При необходимости подтверждения проводят совместный ввод экстракта со стандартом афлатоксинов.

1.5. ПОДТВЕРЖДЕНИЕ НАЛИЧИЯ АФЛАТОКСИНОВ В ПОМОЩЬЮ ДВУМЕРНОЙ ТСХ.

Для подтверждения наличия афлатоксинов пластинку "Силуфол" размечают тонкими карандашными линиями. В правом нижнем углу на расстоянии 1.5 см от краев наносят 20 мкл раствора А, в правом верхнем углу наносят 5 мкл рабочего раствора смеси афлатоксинов. В левом нижнем углу на расстоянии 1, 2 и 3 см от левого края и 1.5 см от нижнего края пластинки наносят 2, 5 и 10 мкл рабочего раствора смеси афлатоксинов. Пластинку помещают в камеру для ТСХ со смесью эфир-метанол-вода (94:4.5:1.5) и развивают пластинку в 1-ом направлении до достижения фронтом растворителя тонкой карандашной линии, проведенной в 3 см от верхнего края пластинки. Пластинку извлекают и сушат на воздухе 5 минут, затем развитие пластинки проводят во втором направлении в системе хлороформ-ацетонвода (90:10:1). После достижения фронтом растворителя карандашной линии ее извлекают из камеры и сушат на воздухе. Рассматривают пластинку в длинноволновом УФ-свете. Обнаружение на пластинке пятен, соответствующих по хроматографической подвижности и цвету флуоресценции пятнам стандартов афлатоксинов, свидетельствует о возможном присутствии афлатоксинов в пищевом продукте. Для подтверждения наличия афлатоксинов ТСХ-пластинку опрыскивают раствором азотной кислоты в воде (1:2) и рассматривают ее в длинноволновом УФ-свете. Если цвет флуоресценции стандартов афлатоксинов изменился с синего (В1, В2) или сине-зеленого (G1, G2) на желтый цвет, а цвет флуоресценции пятен экстракта на желтый не изменился, то афлатоксины в пробе отсутствуют. Если же цвет флуоресценции пятен экстракта также изменился на желтый, то это служит подтверждением возможного наличия афлатоксинов в пищевом продукте.

2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АФЛАТОКСИНОВ В1, В2, G1, G2 В МАСЛАХ

2.1. ЭКСТРАКЦИЯ

К 15 г масла добавляют 25 мл гексана, 5 мл 4%-го раствора хлорида натрия и 100 мл ацетонитрила. Встряхивают на аппарате для встряхивания в течение 40-50 минут. Затем смесь помещают в делительную воронку и отделяют нижний ацетонитрильный слой.

2.2. ОЧИСТКА ЭКСТРАКТА.

Ацетонитрильный экстракт обезжиривают в делительной воронке гексаном (3х50 мл), высушивают сульфатом натрия и упаривают досуха. Остаток растворяют в "мл хлороформа и проводят очистку с помощью колоночной хроматографии. На колонку с 4 г силикагеля (п. 1.2.) наносят хлороформный экстракт, дают хлороформу стечь и промывают 100 мл смеси гексан-бензол-эфир (1:1:2). Афлатоксины элюируют 100 мл смеси хлороформ-ацетон (9:1). Элюат упаривают досуха. Остаток растворяют в 2 мл хлороформа, фильтруют через бумажный или капроновый фильтр, отдувают растворитель в токе азота, растворяют в 400 мкл хлороформа и анализируют с помощью ВЭЖХ (п. 1.4.).

Расчет концентрации афлатоксина проводят по формуле:

         V1 x h x mст.

С = ------------------,

         V2 x hст. x M

C - концентрация афлатоксина в масле;

V1 - объем очищенного раствора экстракта в хлороформе перед ВЭЖХ (200 мкл);

V2 - объем раствора экстракта, вводимого в петлю инжектора хроматографа (20 мкл);

mст - количество нг афлатоксина во введенном объеме стандарта;

hст. - высота пика стандарта афлатоксина в мм;

h - высота пика афлатоксина во введенном объеме экстракта в мм;

М - навеска продукта, взятая в г.

Подтверждение наличия афлатоксина с помощью двумерной ТСХ проводят аналогично п. 1.5.

3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АФЛАТОКСИНА М1 В МОЛОКЕ

3.1. ЭКСТРАКЦИЯ.

В коническую колбу на 250 мл помещают 50 мл натурального молока или раствор 5 г сухого молока в 50 мл воды, 10 мл водного раствора 2 г хлорида натрия и 0.24 г лимонной кислоты, 120 мл хлороформа (все составные части предварительно подогревают до температуры 35-38оС). Содержимое колбы встряхивают 2-3 минуты, переносят в центрифужные стаканы и центрифугируют 15 минут при 3000-40000 об/мин. Отделяют нижний хлороформный слой, высушивают над 10 г безводного сульфата натрия, отфильтровывают, замеряют объем фильтрата (V2) и упаривают до 5 мл.

Очистку проводят с помощью колоночной хроматографии. На дно стеклянной колонки помещают кусочек ваты, затем безводный сульфат натрия (толщина слоя 5мм), заливают суспензию 2 г (2 мл) силикагеля в гексане и сверху насыпают слой безводного сульфата натрия. Дают гексану стечь так, чтобы над слоем сульфата натрия осталось около 5 мл гексана. Вносят 5 мл анализируемого экстракта. Дают растворителю стечь и затем колонку последовательно промывают 25 мл смесями толуол-уксусная кислота (9.5:0.5), 25 мл гексана и 25 мл смеси эфир-гексанацетонитрил (5:3:1). Афлатоксин М1 элюируют с колонки 60 мл смеси хлороформацетон (4:1). Элюат упаривают досуха, растворяют в 200 мкл хлороформа и анализируют с помощью ВЭЖХ.

3.2. ПРИГОТОВЛЕНИЕ СТАНДАРТНОГО РАСТВОРА АФЛАТОКСИНА М1

Навеску кристаллического афлатоксина М1 в 1 мг помещают в мерную колбу на 100 мл и доводят до метки смесью бензол-ацетонитрил (9:1). Концентрация афлатоксина М1 в приготовленном стандартном растворе составляет 10 нг/мкл. Для приготовления стандартного раствора афлатоксина М1 с концентрацией 0.2 нг/мкл в мерную колбу на 50 мл помещают 1 мл стандартного раствора афлатоксина М1 и доводят до метки смесью бензол-ацетонитрил (9:1).

3.3. ОБНАРУЖЕНИЕ И КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛНИЕ АФЛАТОКСИНА М1 С ПОМОЩЬЮ ВЭЖХ

Условия ВЭЖХ: подвижная фаза эфир-метанол-вода (90:8:2), остальные параметры как в п. 1.4. Чувствительность детектора устанавливается таким образом, чтобы 0.6-0.8 нг афлатоксина М1 соответствовало отклонению пера на полную шкалу самописца при уровне шума от 3 до 5% от полной шкалы. Для калибровки флуоресцентного детектора в инжектор вводится 1, 2, 3 мкл рабочего раствора афлатоксина М1, что соответствует 0.2, 0.4, 0.6 нг афлатоксина М1. Для каждого количества афлатоксинов измеряют высоту пика. В приведенных выше условиях ВЭЖХ время удерживания афлатоксина М1 8-9 минут.

В инжектор хроматографа вводится с помощью микрошприца 20 мкл раствора очищенного экстракта. При наличии пика, совпадающего по времени с афлатоксином М1, определяют его высоту (h). Расчет концентрации афлатоксина М1 проводят по формуле:

         V1 x V3 x h x mст.

С = -----------------------

         V2 x V4 x hст. x M

С - концентрация афлатоксина М1 в молоке, мкг/кг;

V1 - объем хлороформа, взятого для экстракции (120 мл);

V2 - объем хлороформного экстракта, взятого для анализа;

V3 - объем очищенного экстракта в хлороформе перед ВЭЖХ (200 мкл);

V4 - объем раствора экстракта, вводимого в петлю инжектора хроматографа (20 мкл);

mст.- количество нг афлатоксина М1 в введенном объеме стандарта;

hст. - высота пика стандарта афлатоксина в мм;

h - высота пика афлатоксина в введенном объеме экстракта в мм;

М - навеска продукта, взятая в г.

Если пик афлатоксина М1 в образце выходит за пределы шкалы самописца, анализ с помощью ВЭЖХ проводят повторно, уменьшая объем вводимого в инжектор раствора экстракта (V4) или разбавляя раствор экстракта хлороформом ( увеличивая объем V3).

3.4. ПОДТВЕРЖДЕНИЕ НАЛИЧИЯ АФЛАТОКСИНА М1 С ПОМОЩЬЮ ДВУМЕРНОЙ ТСХ

Очистка и обнаружение афлатоксина М1

ТСХ-очистку и обнаружение афлатоксина М1 проводят с помощью двумерной ТСХ на пластинках "Силуфол" аналогично п.1.5. В качестве растворителей для развития хроматограмм используют в первом направлении смесь эфир-метанол-вода (90:8:2), во втором направлении смесь хлороформ-ацетон-изопропиловый спирт (85:10:5).

Тесты, подтверждающие наличие афлатоксина М1 в продукте, проводят аналогично п. 1.5.